Sequenciamento de perturbações causadas in vivo aponta o papel de genes de risco para o desenvolvimento do transtorno de espectro autista
por Tayná Fiúza

Uma pequena parte das condições genéticas que conhecemos são unifatoriais, isto é, se manifestam pela influência de um único gene. No geral, as demais condições, chamadas multifatoriais, intrigam pesquisadores de todo o mundo e o número de genes candidatos a explicá-las pode chegar às centenas. É esse o caso do transtorno de espectro autista e de algumas outras condições de desenvolvimento.

Estudos amplos de associação genômica, sequenciamentos de exoma completo e outros estudos podem identificar novos genes de interesse e reforçar a relevância de alguns já descobertos, contudo, não revelam os eventos moleculares que se desdobram para que, no fim, um determinado fenótipo seja observado. Entender o impacto de mutações em cada um desses genes poderia levar décadas, mesmo se cada experimento considerasse um grupo de mutações.

Para resolver esse problema, o protocolo Perturb-Seq, desenvolvido por Xin Jin e colaboradores e publicado no ano passado utiliza edição gênica com CRISPR-Cas9 para inserir variadas mutações - perturbações - em um vasto número de células e tipos celulares e sequenciamento de células únicas para observar, com alta resolução, o impacto dessas perturbações no transcriptoma de cada célula.

O protocolo foi aplicado para a avaliação de 35 genes de risco para o desenvolvimento do transtorno de espectro autista (TEA) e atraso de desenvolvimento. As mutações do tipo mudança de janela de leitura foram provocadas nos cérebros ainda em desenvolvimento de embriões de ratos. Cada perturbação inserida estava atrelada a um código de barras único que permitia a posterior separação das células mutadas por gene alterado e cerca de 40.000 células distintas foram analisadas (Figura 1).

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Legenda: Figura 1. Diagrama do protocolo geral de Perturb-Seq in vivo realizado no trabalho. As mutações são inseridas em genes individuais do embrião no dia 12.5 (E12.5). No dia sete após o nascimento (P7) se obtém o perfil transcriptômico das células resultantes por sequenciamento de RNA de células únicas. As células são analisadas quanto a perturbação celular e o efeito destas perturbações. Fonte: X. Jin et al., Science 370, eaaz6063 (2020). DOI: 10.1126/science.aaz60603

Os transcritos de cinco diferentes tipos celulares foram avaliados no sétimo dia após o nascimento dos animais. Para buscar eventos de maior impacto, foram investigadas mudanças em módulos gênicos que envolvessem processos biológicos comuns aos tipos celulares citados, ou específicos a um desses. Dentre as perturbações que afetaram mais significativamente módulos específicos estão aquelas nos genes: Adnp, Ank2, Ash1l, Chd8 e outros (Figura 2).

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Figura 2: Efeito das perturbações em oligodendrócitos. Em C vemos a expressão média dos genes do módulo OCD1 (linhas) em cada grupo de perturbação (colunas). Em D, há o tamanho do efeito causado por cada perturbação do módulo de ODC1 em comparação ao controle. As barras de erro foram calculadas com intervalo de confiança de 95%. Fonte: X. Jin et al., Science 370, eaaz6063 (2020). DOI: 10.1126/science.aaz60603

O modelo de estudo e o protocolo empregado apontaram resultados que são compatíveis com aqueles obtidos de amostras humanas, tanto em cérebros humanos (pós-morte) de indivíduos com TEA como em organóides de três e seis meses. Dentre as perturbações de destaque, estão aquelas nos genes Chd8 e Gatad2b que reduziram a expressão de um módulo de genes associado à maturação de oligodendrócitos.

Para além da aplicação nesse estudo específico, o protocolo de Perturb-Seq poderá ser empregado para entender o papel de um número ainda maior de genes em outras desordens complexas em órgãos além do cérebro, e em outros estágios de desenvolvimento.

Glossário:

  • Exoma: conjunto de regiões codificadoras (éxons) do DNA.

  • Fenótipo: uma diferença observável nas características de um ser vivo. Pode se tratar de uma diferença na aparência, no desenvolvimento, no comportamento, nos sons, entre outros. Características observadas através de experimentos e análises laboratoriais também são fenótipo. O fenótipo é determinado pelo genótipo e pelo ambiente que influencia estes genes.

  • CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas) são pequenas porções do DNA bacteriano compostas por repetições de nucleotídeos. Este termo é frequentemente utilizado para se referir a utilização de CRISPR juntamente com o sistema Cas9, uma técnica que permite a deleção seletiva de DNA.

  • Mutação de mudança na janela de leitura (Frameshift Mutation): o material genético é lido em trincas (ou trios), esta é a janela de leitura. Quando uma mutação insere ou deleta um número diferente de 3 ou 3xN nucleotídeos, ocorre uma mudança na janela de leitura. Exemplo utilizando palavras trinas: “EVA-VIU-UVA”, com a inserção de um E, vira “EVE-AVI-UUV-A”.

  • Transcriptoma: conjunto completo de transcritos - RNAs mensageiros, RNAs ribossômicos, RNAs transportadores e os microRNAs - de uma amostra, podendo compreender desde organismos inteiros até células únicas.

Para saber mais:

In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes

CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling